RNAfold Web Serverによるアプタマー二次構造予測【in silico創薬】

RNA foldとは？

RNAfold Web Serverは、RNAの塩基配列からその二次構造を予測するためのオンラインツールです。オーストリアのウィーン大学によって開発された ViennaRNA Package の一部であり、RNAfoldコマンドラインツールのWeb版にあたります。ユーザーは、RNAの一次配列（A, U, G, Cからなる文字列）を入力するだけで、計算に基づいて最も安定な構造（自由エネルギーが最小になる構造）を可視化できます。商用利用も可能となっています。

アプタマーとその二次構造予測

アプタマー（Aptamer）は、特定の分子（タンパク質や小分子）と強く結びつく短いRNAまたは一本鎖DNAのことです。アプタマーは、抗体のように特定の標的を選んで結合する性質を持っていますが、化学的に合成できる点が大きな特徴です。

今回取り上げる以下の文献では，SARS-CoV-2スパイクタンパク質に対するアプタマーDNAとしてRBD-1CM1がin silicoで選択されました。本記事では，RNAfold Web Serverを用いて，このRBD-1CM1の二次構造を予測し，どのような結合特性を示すものかを調べてみましょう。

In-Silico Selection of Aptamer Targeting SARS-CoV-2 Spike Protein

RNAfold Web Serverの使い方

RNA配列を調べる

まず、解析対象のアプタマーのRNA配列（塩基配列）を調べます。RBD-1CM1の配列は論文中に掲載されていて，次のようになっています。

5'-CAGCACCGACCTTGTGCTTTGGGAGTGCTGGTCTAAGGGCGTTAATAGACA-3'

RNAfold Web Serverに配列を入力

RNAfold Web Serverにアクセスし「Sequence Input」欄にRNA配列を貼り付けます。

論文では特にパラメータの設定が他にないので、デフォルトの設定で二次構造を予測します。

今回は，初期設定のままで実行します。 画面をスクロールして右下のボタンをクリックします。

しばらくすると（3分くらい）画面が切り替わり解析結果が表示されます。

結果

以下のようなアウトプットになります。

DNAで予測しましたが、出力はRNAになっているようです。（TがUになっている）

最小自由エネルギー予測の結果（Results of minimum free energy prediction)

ドット・ブラケット表記で最も安定な二次構造が示されます。

ドット・ブラケット表記では，

• ( と) が塩基対
• . が（塩基対になっていない）非結合の塩基

となります。

最小自由エネルギーは-14.90kcal/molで，このときRBD-1CM1の二次構造のドット・ブラケット表記はこうなりました。

CAGCACCGACCUUGUGCUUUGGAGUGCUGGUCUAAGGGCGUUAAUAGACA
((((((...(((........))).))))))(((((..........))))).

この結果から，RBD-1CM1が，複数のステム-ループ構造を含み，典型的な機能性RNAの構造をもつことがわかります。2つのステムがありますが，片方のステムには，小さなヘアピン構造を持ち，構造的に安定的な領域を作っています。もう一つのステムは，長めのループを含んでいます。これは，特定の分子と相互作用する認識部位である可能性が高いです。後述するように，RNAfold Web Serverでは二次構造のグラフィックも表示されるため，視覚的にこれらのことを確認することができます。

熱力学的アンサンブル予測の結果（Results for thermodynamic ensemble prediction）

The free energy of the thermodynamic ensemble is -15.38 kcal/mol.
The frequency of the MFE structure in the ensemble is 46.04 %.
The ensemble diversity is 7.80 .

熱力学的アンサンブルの自由エネルギーが-15.38 kcal/molというのは比較的安定な構造といえます。

最も安定（最低エネルギー）である構造の出現頻度が46.04%ですので，明確に１つの安定構造をもちます。一方で，他の構造もかなりの割合で存在していることがわかります。

アンサンブル多様性は7.80とやや高めです。(0 に近いほど構造が一様。10 以上で多様。)

つまり，特定の1構造に完全に固定されているわけではなく，柔軟に異なる構造をとれるようになっています。

以上より，RBD1-CM1は安定性と柔軟性のバランスが取れたRNAであり，環境変化に応じて構造を変えるような機能RNAとして性質を持っている可能性が高いといえるでしょう。

2次構造のグラフィック

最適構造の図がプロットされます。塩基対確率を符号化した構造図，位置エントロピーを符号化した構造図も得られます。左がRNA、右がDNAを表しており、下の赤枠でDisplay optionを変えれます。

塩基対確率（Base-pair probalities)を符号した最適構造

この図は、RNAの二次構造を表しており、各塩基の色は構造の安定性（ペアになっている確率）を示しています。赤い部分は非常に安定で、塩基同士が強く結合していることを意味します。黄色や緑はやや不安定で、結合の確実性が低いことを示します。青に近いほど結合せず、ループなど自由に動ける部分です。全体として、中央のステム部分は安定した構造を持ち、両端のループ領域は柔軟性が高い構造になっていることがわかります。

位置エントロピー(Positional Entropy)を符号化した最適構造

この図は、RNAの中で「構造が決まりやすい塩基」と「揺らぎが大きい塩基」を色で見せたものです。青はエントロピーが高く、不安定、逆に赤い部分は安定ということを示しています。

マウンテンプロット（Mountain Plot）

マウンテンプロットは、RNAの二次構造の全体的な形や安定性を視覚的に表現するグラフです。

• 横軸：RNAの塩基番号
• 縦軸：その塩基が構造中でどれだけステム（塩基対）に関与しているか、または構造の高さ

上段：Height（構造の高さ）

線の意味：

• 🔴 赤（mfe）：最小自由エネルギー構造（Minimum Free Energy）
• 🟢 緑（pf）：全配列のペアリング確率（partition function による期待値）
• 🔵 青（centroid）：中心構造（ペアリング確率に基づく代表的構造）

解釈：

• 高さが高いほど、ペアになっている構造のステム（stem）が高い＝安定したヘリックスを示唆
• mfe, pf, centroid がほぼ重なっていれば、構造予測に一貫性があることを意味します
• もし大きくズレているなら、不確実性が高い or alternative structure が存在することを示唆

下段：Entropy（エントロピー）

• 各位置における**構造の不確実性（情報エントロピー）**を示しています
• 値が高い ≒ その位置の塩基がどの塩基と結合するかが多様で不安定
• 値が低い ≒ その塩基のペア形成が安定しており、予測構造が定まっている

解釈の例：

• エントロピーが高い領域 → いくつかの構造パターンが競合している
• エントロピーが低い領域 → ステムなどで明確な二次構造が形成されている

この図からわかることは：

1. 全体の構造は比較的安定しており、mfe・pf・centroidがよく一致している（赤・緑・青の重なりが大きい）。
2. エントロピーが高い領域（10–15や35–45あたり）では、構造の予測が不確かで、代替構造が存在する可能性あり。
3. エントロピーが低い位置は信頼性が高い（20–30あたりは構造が明確）。

総じて、この結果から分かることは

• 「配列の安定なステム領域」と「可変的なループや不確実な領域」が明確に分かれています。
• siRNA設計や構造機能解析で使う場合、「エントロピーが低い領域＝安定結合部位」として注目されます。

最後に

いかがでしたでしょうか？

RNAfold Web Serverは、RNAやDNA配列の二次構造を簡単に予測できる無料ツールです。視覚的に安定性や柔軟性も確認でき、アプタマー設計にも役立ちます。

次の記事ではアプタマーの3次元構造の予測を行なっていきます！

参考文献

Lin YC, Chen WY, Hwu ET, Hu WP. In-Silico Selection of Aptamer Targeting SARS-CoV-2 Spike Protein. Int J Mol Sci. 2022 May 22;23(10):5810. doi: 10.3390/ijms23105810. PMID: 35628622; PMCID: PMC9143595.

RNAfold web server